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離子交換層析介質(zhì)的應(yīng)用
發(fā)布時間:2020-04-27

       離子交換層析分離純化生物大分子的過程,主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進行選擇分離的。現(xiàn)已成為分離純化生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)中使用最頻繁的純化技術(shù)之一。

1. 離子交換劑的選擇

       在進行分離純化時,要求層析柱具有高負載量、易于操作及使用壽命長等特點,其中分離介質(zhì)是最主要的影響因素,因此,分離介質(zhì)的選擇尤為重要。

1.1 品種的選擇:

       應(yīng)根據(jù)被分離純化目標產(chǎn)物所帶電荷的種類、分子的大小、物理化學性質(zhì)及所處的微環(huán)境等因素,選擇適宜的離子交換層析介質(zhì)。對于無機小分子而言,分離介質(zhì)的選擇相對容易,但對于生物大分子就必須考慮更多的因素。

       蛋白質(zhì)等生物大分子是由多種氨基酸所組成的,在不同的pH條件下顯示不同的電性,而生物大分子對最適宜的pH環(huán)境具有特定的要求,因此,必須首先了解目標蛋白的等電點及適宜的微環(huán)境,根據(jù)這些條件選擇合適的離子交換劑種類。

       是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑,主要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH 下所帶的電荷,如果帶正電,則選擇陽離子交換劑;如帶負電,則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4,穩(wěn)定的pH 范圍為6~9,由于這時蛋白帶負電,故應(yīng)選擇陰離子交換劑進行分離。

1.2 骨架的選擇:

       應(yīng)根據(jù)目標產(chǎn)品的產(chǎn)量、要求達到的純度及經(jīng)濟價值等因素,選擇合適骨架(基質(zhì))的離子交換劑。

       通用型的聚苯乙烯離子交換樹脂具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價格低廉、全交換容量高等特點,適用于如抗生素、有機酸、動物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產(chǎn)品,仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的生化分離專用介質(zhì)。

       纖維素離子交換劑價格較低,但分辨率和穩(wěn)定性都較低,適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中,但受外界影響較大,體積可能隨離子強度和pH 變化有較大改變,影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩(wěn)定性較好,分辨率也較高,但價格較貴。

       理想的分離介質(zhì)應(yīng)該不但易于吸附,還要易于洗脫,如果目標產(chǎn)物對于離子強度和pH值的變化不敏感,可以考慮采用高電荷密度的強酸性或強堿性的強型介質(zhì)。如果對這些因素比較敏感,則應(yīng)采用弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)。如果大分子物質(zhì)被吸附后,結(jié)合比較牢固,往往難以洗脫,采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性,則應(yīng)選用功能基團密度低的介質(zhì)。

       強酸性或強堿性的強型介質(zhì),適用的pH 范圍廣,常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH 下的分離,但由于電性較強,有時易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì),其選擇性有較大的范圍,且不易使蛋白質(zhì)失活,故一般適用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),但其適用的pH范圍較窄。

1.3 粒徑的選擇:

       分離介質(zhì)粒徑的大小對離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來說分離介質(zhì)的粒徑小,分辨率高,但平衡離子的平衡時間長,流速慢;粒徑大則柱的流速較快,壓降小,但分辨率低,負載量也較小。所以大顆粒的分離介質(zhì)適合于對分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離,而小顆粒的分離介質(zhì)適合于需要高分辨率的精細分離或產(chǎn)品的精制階段。

2. 操作中注意事項

2.1 預(yù)處理:

       在離子交換劑的工業(yè)產(chǎn)品中,常含有少量的有機低聚物及一些無機雜質(zhì),在使用初期會逐漸溶解釋放,影響目標產(chǎn)品的質(zhì)量。因此,工業(yè)級離子交換劑在使用前必須進行預(yù)處理。

       通用型的離子交換樹脂通常使用酸、堿進行處理,可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液,以4~6倍樹脂床體積交替進行處理,在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對于大孔型的樹脂,還需要用乙醇、丙酮等有機溶劑進行處理,以除去生產(chǎn)過程中所用的有機物殘余物。對分離介質(zhì)進行預(yù)處理,不但能提高其工作容量,更可提高被分離產(chǎn)品的純度。經(jīng)預(yù)處理后的樹脂,最后應(yīng)轉(zhuǎn)為分離過程中適用的離子型態(tài)。

       對于生化專用的離子交換劑,以多糖類骨架為主的介質(zhì),一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質(zhì)在分離過程中盡量減少pH值的變化,需要用大量的去離子水進行清洗,然后用緩沖液進行平衡。

       分離介質(zhì)的預(yù)處理可以在柱內(nèi)進行,也可以在燒杯等容器中進行。在柱內(nèi)進行預(yù)處理時,或溶液體系改變及操作溫度變化時,經(jīng)常會出現(xiàn)氣泡,尤其在使用內(nèi)徑較小的柱時。氣泡一經(jīng)出現(xiàn),必須及時清除,否則對層析工藝有明顯的影響。

2.2 緩沖液平衡介質(zhì):

       pH值是離子交換層析的操作中的一個重要因素,而pH的穩(wěn)定及改變通常是用緩沖液來實現(xiàn)的,所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。

       在選擇緩沖液時,pH和離子強度是兩個關(guān)鍵性的因素,它不僅影響到分離介質(zhì)對目標產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果,而且還影響到產(chǎn)品的收率。選用的pH值取決于目標產(chǎn)物的等電點、穩(wěn)定性和溶解度,不但要使被分離的物質(zhì)成為可以進行交換的離子,還要維持其較高的活性。同時也應(yīng)該考慮到離子交換劑的pK值。

       由于緩沖液本身帶電,所以也會與離子交換層析介質(zhì)結(jié)合。這種結(jié)合將帶來兩方面的干擾,一方面降低緩沖液的濃度,進而降低了緩沖能力;另一方面是與分離介質(zhì)進行交換,從而與蛋白質(zhì)競爭介質(zhì)的交換容量。因此,在使用陰離子交換層析介質(zhì)時,要避免采用磷酸鹽之類的帶負電的緩沖液,在使用陽離子交換層析介質(zhì)時,則要避免采用Tris之類的帶正電的緩沖液。由于分離介質(zhì)的種類不同,起始過程也略有不同,在通常情況下,使用陰離子交換層析介質(zhì)時,起始緩沖液要高于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值;使用陽離子交換層析介質(zhì)時,則起始緩沖液要低于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值。

2.3 層析柱的操作:

2.3.1 操作方式:

       由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動相,可在流經(jīng)柱時進行分離,因此,離子交換可以采用柱式操作,以層析形式進行分離。在分離過程中,未被吸附的物質(zhì)不斷流出反應(yīng)體系,使平衡不斷右移,是一種動態(tài)平衡,所以也稱為動態(tài)操作。動態(tài)操作方式分離效果好,適用于各類樣品,可實現(xiàn)連續(xù)操作。在層析分離的操作中,層析柱的裝填情況對分離有一定的影響,介質(zhì)在柱內(nèi)要分布均勻,尤其不允許氣泡的存在,也應(yīng)防止介質(zhì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象。

       對于一些粘度較大的樣品,進行初步提取分離時,也可以采用“靜態(tài)”處理方法,經(jīng)離子交換劑與需處理的工作液在反應(yīng)容器中進行攪拌,當達到吸附平衡后,將介質(zhì)與殘液分離,裝入柱中進行洗脫。這種靜態(tài)分批操作的方法,工藝設(shè)備簡單,操作簡便,如肝素鈉等一些天然產(chǎn)物的初步分離,往往采用這種靜態(tài)分離方式。在靜態(tài)分離方式的操作中,應(yīng)適當控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度,若攪拌速度過快,剪切力過大,會造成離子交換顆粒的破碎,難以進行過濾分離;但若攪拌速度過慢,則影響介質(zhì)與工作液的接觸,也影響交換速率。

2.3.2 柱式操作的種類:

       固定床分離:在柱式操作中,料液作為流動相,在柱內(nèi)自上而下地流動,在流動的過程中進行吸附。為了得到較好的分離效果,對分離柱有三點最基本的要求:分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板,以防止流動相產(chǎn)生偏流;分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小,以防止分離過程中色譜帶混合或擴展;無論大小,分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中,可以進行正向洗脫,也可以進行逆向洗脫,一般情況下,逆向洗脫或再生可獲得較好的效果,但對操作有較為嚴格的要求。

       流態(tài)床:流動的料液從柱的下端流入,從上端流出,分離介質(zhì)在柱內(nèi)呈流態(tài)狀。此種分離方法對操作有嚴格的要求,一般較少應(yīng)用,洗脫方式以采用正向洗脫為好。

2.3.3 工作液對分離效果的影響:

       為了使生化分離達到高分辨率及高負載量,工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果,還影響到分離介質(zhì)的使用壽命。生化分離往往是一個比較復雜的體系,其中有多種雜質(zhì)存在,不但有簡單的小分子,還有一些膠體物質(zhì)、脂類物質(zhì)等,尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質(zhì)的功能基團,或堵塞了介質(zhì)的孔道,造成不可逆污染,縮短分離介質(zhì)的使用壽命。因此,在分離操作前,應(yīng)盡量將工作液進行適當?shù)念A(yù)處理,以確保分離的效果。

       在生化分離純化過程中,由于淋洗過程帶走了一些目標產(chǎn)物,或因洗脫不完全而使目標產(chǎn)物滯留在介質(zhì)上,造成產(chǎn)物的損失,是影響產(chǎn)品收率的重要因素,同時,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化引起失活,也將影響活化收率。在離子交換過程中加入一些穩(wěn)定劑或保護劑,不但可以提高收率,還可提高分離介質(zhì)對蛋白質(zhì)的選擇性。

2.3.4 流速對分離效果的影響:

       離子交換層析分離中,流速是影響分離效果的一個重要因素。為了獲取優(yōu)良的分離效果,應(yīng)根據(jù)離子交換劑的種類、粒徑、工作液中有效成分的分子結(jié)構(gòu)等因素,進行試驗,以確立較佳的試驗參數(shù)。若目標產(chǎn)物的分子量相對比較小,且介質(zhì)的孔徑比較大時,因為有利于傳質(zhì)作用,可采用較高的流速。而對于目標產(chǎn)物為生物大分子,且介質(zhì)的孔徑相對于被分離物質(zhì)分子較小時,由于分子的擴散速率較慢,則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時,因傳質(zhì)速率較低,也應(yīng)采用較低的流速。

       流速不但影響交換吸附的效果,也影響洗脫的效果,通常情況下,洗脫時的流速要比交換吸附時慢些。

2.4 介質(zhì)的洗脫、再生方式:

       當離子交換劑失效后,應(yīng)進行洗脫,其基本原理是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子或基團,把交換吸附到介質(zhì)顆粒外表面和內(nèi)部的目標產(chǎn)物解吸下來。吸著物不同,其活潑性不同,因此,應(yīng)選擇合適的洗脫劑,將蛋白質(zhì)從介質(zhì)上洗脫下來,收集分離純化的產(chǎn)物。

       離子交換層析大致有三種洗脫方式:

       一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質(zhì),可采用稀的酸、堿或鹽類溶液,也可選用適當?shù)挠袡C溶劑,其中以鹽溶液為主,依據(jù)目標產(chǎn)物的性質(zhì)及最終得到產(chǎn)物的劑型進行選擇。由于被吸著的物質(zhì)往往不是單一的品種,各種物質(zhì)所帶的電荷電量不同,與介質(zhì)的結(jié)合強度不同,即使使用同一種洗脫劑,容易被替換的物質(zhì)先脫離介質(zhì)流出,結(jié)合力較強的物質(zhì)后流出,只要通過分級收集,就可以把各種物質(zhì)分離,得到較純凈的產(chǎn)物。這種方法多用于對目標產(chǎn)物的性能了解很清楚時的分離,或用于分析類的分離。

       第二種為分步洗脫,即分別用不同濃度的鹽溶液進行洗脫。分離介質(zhì)在交換吸附過程中,會有多種蛋白質(zhì)被吸附,如果采用一個恒定的洗脫條件,有時不能將所有的組分適當?shù)胤珠_,需要改變洗脫條件。可以是階段式的改變,即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進行洗脫,可以根據(jù)洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標蛋白,不同的鹽濃度可以得到不同的目標蛋白。這種分步洗脫的方式,適用于已知性質(zhì)蛋白的分離,尤其適用于規(guī)模生產(chǎn)中,操作方便,易于控制。

       第三種為連續(xù)的梯度洗脫,即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強度或pH值(一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式),在洗脫劑漸變的過程中,將不同的蛋白質(zhì)逐一置換,可得到各種不同的蛋白組分,同時,蛋白質(zhì)一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式,也是洗脫能力相對最強的洗脫方式,適合于對電荷性質(zhì)相近組分的洗脫。

       在洗脫過程中,順流洗脫或逆流洗脫均可采用,順流洗脫也稱為正向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相同,逆流洗脫也稱為反向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相反。若料液是自上而下正向通過交換柱進行交換吸附的,則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高,洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復雜得多,故目前多以正向洗脫為主。

       洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離的效果,洗脫速度通常要保持恒定。一般來說,慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好,但洗脫速度過慢,會造成分離時間長,樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用,所以要根據(jù)實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中于某個區(qū)域造成重疊,則應(yīng)適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率。如果分辨率較好,但洗脫峰過寬,則應(yīng)適當提高洗脫速度。

2.5 介質(zhì)的消毒:

       在某些純度要求較高的生化產(chǎn)品制備過程中,往往要求對分離介質(zhì)進行消毒處理,以防止微生物等雜質(zhì)混入目標產(chǎn)品中。

       采用高溫消毒是最常用的方法,目前大多數(shù)離子交換劑具有穩(wěn)定的物理化學性能,均可進行高溫消毒處理。但在使用多糖類介質(zhì)時,必須注意,介質(zhì)一定要處于鹽型,而且要在中性條件下才能進行高溫消毒處理,否則將會導致多糖大分子骨架的降解,嚴重影響介質(zhì)的使用壽命。

       NaOH也是一種很好的消毒劑,但要根據(jù)介質(zhì)的耐堿程度和微生物污染的種類、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內(nèi)浸泡法,即將一定濃度的NaOH通入柱中,關(guān)閉出液閥,浸泡幾個小時后,可達到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用,可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。

2.6 介質(zhì)的“復蘇”:

       在生化分離過程中,由于分離體系較為復雜,含有多種蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì),因此在使用過程中常出現(xiàn)樹脂的“中毒”現(xiàn)象。中毒原因可能是由于大分子的多點帶電,與介質(zhì)進行多點結(jié)合,致使難以洗脫,使介質(zhì)的有效功能基團減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內(nèi),難以擴散出來,堵塞了孔道,在以后的交換過程中影響到顆粒內(nèi)功能基團的有效工作。除生物大分子外,色素及腐殖酸等都可使介質(zhì)中毒。有時工作液中的膠狀物質(zhì)被粘附于介質(zhì)顆粒的內(nèi)外表面,覆蓋了功能基團,這也是影響介質(zhì)工作容量的重要因素。

       由于上述原因,離子交換層析介質(zhì)在使用一段時間后,可能出現(xiàn)顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質(zhì)收率降低、反壓升高等現(xiàn)象。此時,需要對介質(zhì)進行凈化處理。對于介質(zhì)用量比較大,自動化程度比較高的規(guī)模生產(chǎn),應(yīng)采用在原交換柱內(nèi)進行,即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過適量的清水,目的是去除交換柱中的懸浮物,并將床體疏松,還可以將結(jié)塊的介質(zhì)分散,有利于以后介質(zhì)與清洗液的接觸。對于一般的污染,采用逆流清洗,可減少污染物對下層介質(zhì)的污染。應(yīng)根據(jù)介質(zhì)種類及污染程度的不同,分別選用不同種類的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質(zhì)是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡,各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經(jīng)過上述處理后仍無明顯改善,尤其是流速無明顯提高,則要檢查交換柱布水器的紗網(wǎng)是否出現(xiàn)堵塞。

       上述過程即為通常所說的“復蘇”過程。不同的介質(zhì)應(yīng)選用不同的復蘇方法,主要取決于介質(zhì)的物理化學性能及污染物質(zhì)的性質(zhì)。對于多糖類的離子交換劑,每當使用一段時間后,可采用離子濃度較大的緩沖液通過交換柱或浸泡介質(zhì),因為緩沖液的離子強度較大時,有利于蛋白質(zhì)大分子脫離介質(zhì),達到復蘇的效果。對于物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介質(zhì),也可使用NaCl溶液通過交換柱或浸泡介質(zhì)。對于物化結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的介質(zhì),可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進行洗脫或浸泡,在高溫下可使吸附在介質(zhì)上的蛋白變性或加快擴散速度,也有利于膠體物質(zhì)的破壞,從而使污染物脫離介質(zhì)。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl,更有利于介質(zhì)的復蘇。

       清除沉淀蛋白、脂類、疏水性的蛋白及脂蛋白,處理步驟更為復雜??刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過這些清洗劑后,都要用至少2倍體積的蒸餾水進行清洗。使用有機溶劑后,交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進行清洗,即可以在5倍床體積內(nèi),使溶劑的含量從0增至100%,然后在下一個5倍床體積中,使溶劑的含量從100%降到0。

       如果經(jīng)過上述處理,交換柱的工作情況仍沒有恢復,可以使用蛋白水解酶,將仍滯留在介質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進行水解,使其脫離介質(zhì)。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中,在室溫下浸泡過夜,或在37℃下浸泡一小時。根據(jù)污染物的情況,也可以采用DNA酶等其它的酶類。無論使用哪一種酶處理后,都要重復上述清除污染物的清洗步驟,把酶清洗干凈。

       脂蛋白對分離介質(zhì)的污染比較嚴重,因為脂蛋白及其它脂類物質(zhì),很容易粘附在層析柱內(nèi),最好在進行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑,可去除高含量的脂蛋白。

2.6 介質(zhì)的貯存:

       各種分離介質(zhì)在使用后都要進行清洗后再貯存,這對于多糖類分離介質(zhì)尤為重要。分離介質(zhì)在使用后,先用2個床體積的清水清洗,然后用2個床體積的20%的乙醇過柱。對于SP強酸性陽離子介質(zhì),要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗,再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經(jīng)過處理后,可在室溫下貯存,或在4~8℃下長期存放。貯存過程中必須將層析柱全部封閉,以防止水分的揮發(fā),造成干柱。暫時不用的介質(zhì)必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質(zhì),都要在4℃~30℃的條件下貯存,并防止冷凍。

       離子交換層析分離純化生物大分子的過程,主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進行選擇分離的。現(xiàn)已成為分離純化生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)中使用最頻繁的純化技術(shù)之一。

1. 離子交換劑的選擇

       在進行分離純化時,要求層析柱具有高負載量、易于操作及使用壽命長等特點,其中分離介質(zhì)是最主要的影響因素,因此,分離介質(zhì)的選擇尤為重要。

1.1 品種的選擇:

       應(yīng)根據(jù)被分離純化目標產(chǎn)物所帶電荷的種類、分子的大小、物理化學性質(zhì)及所處的微環(huán)境等因素,選擇適宜的離子交換層析介質(zhì)。對于無機小分子而言,分離介質(zhì)的選擇相對容易,但對于生物大分子就必須考慮更多的因素。

       蛋白質(zhì)等生物大分子是由多種氨基酸所組成的,在不同的pH條件下顯示不同的電性,而生物大分子對最適宜的pH環(huán)境具有特定的要求,因此,必須首先了解目標蛋白的等電點及適宜的微環(huán)境,根據(jù)這些條件選擇合適的離子交換劑種類。

       是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑,主要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH 下所帶的電荷,如果帶正電,則選擇陽離子交換劑;如帶負電,則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4,穩(wěn)定的pH 范圍為6~9,由于這時蛋白帶負電,故應(yīng)選擇陰離子交換劑進行分離。

1.2 骨架的選擇:

       應(yīng)根據(jù)目標產(chǎn)品的產(chǎn)量、要求達到的純度及經(jīng)濟價值等因素,選擇合適骨架(基質(zhì))的離子交換劑。

       通用型的聚苯乙烯離子交換樹脂具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價格低廉、全交換容量高等特點,適用于如抗生素、有機酸、動物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產(chǎn)品,仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的生化分離專用介質(zhì)。

       纖維素離子交換劑價格較低,但分辨率和穩(wěn)定性都較低,適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中,但受外界影響較大,體積可能隨離子強度和pH 變化有較大改變,影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩(wěn)定性較好,分辨率也較高,但價格較貴。

       理想的分離介質(zhì)應(yīng)該不但易于吸附,還要易于洗脫,如果目標產(chǎn)物對于離子強度和pH值的變化不敏感,可以考慮采用高電荷密度的強酸性或強堿性的強型介質(zhì)。如果對這些因素比較敏感,則應(yīng)采用弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)。如果大分子物質(zhì)被吸附后,結(jié)合比較牢固,往往難以洗脫,采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性,則應(yīng)選用功能基團密度低的介質(zhì)。

       強酸性或強堿性的強型介質(zhì),適用的pH 范圍廣,常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH 下的分離,但由于電性較強,有時易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì),其選擇性有較大的范圍,且不易使蛋白質(zhì)失活,故一般適用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),但其適用的pH范圍較窄。

1.3 粒徑的選擇:

       分離介質(zhì)粒徑的大小對離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來說分離介質(zhì)的粒徑小,分辨率高,但平衡離子的平衡時間長,流速慢;粒徑大則柱的流速較快,壓降小,但分辨率低,負載量也較小。所以大顆粒的分離介質(zhì)適合于對分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離,而小顆粒的分離介質(zhì)適合于需要高分辨率的精細分離或產(chǎn)品的精制階段。

2. 操作中注意事項

2.1 預(yù)處理:

       在離子交換劑的工業(yè)產(chǎn)品中,常含有少量的有機低聚物及一些無機雜質(zhì),在使用初期會逐漸溶解釋放,影響目標產(chǎn)品的質(zhì)量。因此,工業(yè)級離子交換劑在使用前必須進行預(yù)處理。

       通用型的離子交換樹脂通常使用酸、堿進行處理,可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液,以4~6倍樹脂床體積交替進行處理,在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對于大孔型的樹脂,還需要用乙醇、丙酮等有機溶劑進行處理,以除去生產(chǎn)過程中所用的有機物殘余物。對分離介質(zhì)進行預(yù)處理,不但能提高其工作容量,更可提高被分離產(chǎn)品的純度。經(jīng)預(yù)處理后的樹脂,最后應(yīng)轉(zhuǎn)為分離過程中適用的離子型態(tài)。

       對于生化專用的離子交換劑,以多糖類骨架為主的介質(zhì),一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質(zhì)在分離過程中盡量減少pH值的變化,需要用大量的去離子水進行清洗,然后用緩沖液進行平衡。

       分離介質(zhì)的預(yù)處理可以在柱內(nèi)進行,也可以在燒杯等容器中進行。在柱內(nèi)進行預(yù)處理時,或溶液體系改變及操作溫度變化時,經(jīng)常會出現(xiàn)氣泡,尤其在使用內(nèi)徑較小的柱時。氣泡一經(jīng)出現(xiàn),必須及時清除,否則對層析工藝有明顯的影響。

2.2 緩沖液平衡介質(zhì):

       pH值是離子交換層析的操作中的一個重要因素,而pH的穩(wěn)定及改變通常是用緩沖液來實現(xiàn)的,所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。

       在選擇緩沖液時,pH和離子強度是兩個關(guān)鍵性的因素,它不僅影響到分離介質(zhì)對目標產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果,而且還影響到產(chǎn)品的收率。選用的pH值取決于目標產(chǎn)物的等電點、穩(wěn)定性和溶解度,不但要使被分離的物質(zhì)成為可以進行交換的離子,還要維持其較高的活性。同時也應(yīng)該考慮到離子交換劑的pK值。

       由于緩沖液本身帶電,所以也會與離子交換層析介質(zhì)結(jié)合。這種結(jié)合將帶來兩方面的干擾,一方面降低緩沖液的濃度,進而降低了緩沖能力;另一方面是與分離介質(zhì)進行交換,從而與蛋白質(zhì)競爭介質(zhì)的交換容量。因此,在使用陰離子交換層析介質(zhì)時,要避免采用磷酸鹽之類的帶負電的緩沖液,在使用陽離子交換層析介質(zhì)時,則要避免采用Tris之類的帶正電的緩沖液。由于分離介質(zhì)的種類不同,起始過程也略有不同,在通常情況下,使用陰離子交換層析介質(zhì)時,起始緩沖液要高于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值;使用陽離子交換層析介質(zhì)時,則起始緩沖液要低于目標蛋白等電點0.5 ~ 1 pH值。

2.3 層析柱的操作:

2.3.1 操作方式:

       由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動相,可在流經(jīng)柱時進行分離,因此,離子交換可以采用柱式操作,以層析形式進行分離。在分離過程中,未被吸附的物質(zhì)不斷流出反應(yīng)體系,使平衡不斷右移,是一種動態(tài)平衡,所以也稱為動態(tài)操作。動態(tài)操作方式分離效果好,適用于各類樣品,可實現(xiàn)連續(xù)操作。在層析分離的操作中,層析柱的裝填情況對分離有一定的影響,介質(zhì)在柱內(nèi)要分布均勻,尤其不允許氣泡的存在,也應(yīng)防止介質(zhì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象。

       對于一些粘度較大的樣品,進行初步提取分離時,也可以采用“靜態(tài)”處理方法,經(jīng)離子交換劑與需處理的工作液在反應(yīng)容器中進行攪拌,當達到吸附平衡后,將介質(zhì)與殘液分離,裝入柱中進行洗脫。這種靜態(tài)分批操作的方法,工藝設(shè)備簡單,操作簡便,如肝素鈉等一些天然產(chǎn)物的初步分離,往往采用這種靜態(tài)分離方式。在靜態(tài)分離方式的操作中,應(yīng)適當控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度,若攪拌速度過快,剪切力過大,會造成離子交換顆粒的破碎,難以進行過濾分離;但若攪拌速度過慢,則影響介質(zhì)與工作液的接觸,也影響交換速率。

2.3.2 柱式操作的種類:

       固定床分離:在柱式操作中,料液作為流動相,在柱內(nèi)自上而下地流動,在流動的過程中進行吸附。為了得到較好的分離效果,對分離柱有三點最基本的要求:分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板,以防止流動相產(chǎn)生偏流;分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小,以防止分離過程中色譜帶混合或擴展;無論大小,分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中,可以進行正向洗脫,也可以進行逆向洗脫,一般情況下,逆向洗脫或再生可獲得較好的效果,但對操作有較為嚴格的要求。

       流態(tài)床:流動的料液從柱的下端流入,從上端流出,分離介質(zhì)在柱內(nèi)呈流態(tài)狀。此種分離方法對操作有嚴格的要求,一般較少應(yīng)用,洗脫方式以采用正向洗脫為好。

2.3.3 工作液對分離效果的影響:

為了使生化分離達到高分辨率及高負載量,工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果,還影響到分離介質(zhì)的使用壽命。生化分離往往是一個比較復雜的體系,其中有多種雜質(zhì)存在,不但有簡單的小分子,還有一些膠體物質(zhì)、脂類物質(zhì)等,尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質(zhì)的功能基團,或堵塞了介質(zhì)的孔道,造成不可逆污染,縮短分離介質(zhì)的使用壽命。因此,在分離操作前,應(yīng)盡量將工作液進行適當?shù)念A(yù)處理,以確保分離的效果。

       在生化分離純化過程中,由于淋洗過程帶走了一些目標產(chǎn)物,或因洗脫不完全而使目標產(chǎn)物滯留在介質(zhì)上,造成產(chǎn)物的損失,是影響產(chǎn)品收率的重要因素,同時,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化引起失活,也將影響活化收率。在離子交換過程中加入一些穩(wěn)定劑或保護劑,不但可以提高收率,還可提高分離介質(zhì)對蛋白質(zhì)的選擇性。

2.3.4 流速對分離效果的影響:

       離子交換層析分離中,流速是影響分離效果的一個重要因素。為了獲取優(yōu)良的分離效果,應(yīng)根據(jù)離子交換劑的種類、粒徑、工作液中有效成分的分子結(jié)構(gòu)等因素,進行試驗,以確立較佳的試驗參數(shù)。若目標產(chǎn)物的分子量相對比較小,且介質(zhì)的孔徑比較大時,因為有利于傳質(zhì)作用,可采用較高的流速。而對于目標產(chǎn)物為生物大分子,且介質(zhì)的孔徑相對于被分離物質(zhì)分子較小時,由于分子的擴散速率較慢,則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時,因傳質(zhì)速率較低,也應(yīng)采用較低的流速。

       流速不但影響交換吸附的效果,也影響洗脫的效果,通常情況下,洗脫時的流速要比交換吸附時慢些。

2.4 介質(zhì)的洗脫、再生方式:

       當離子交換劑失效后,應(yīng)進行洗脫,其基本原理是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子或基團,把交換吸附到介質(zhì)顆粒外表面和內(nèi)部的目標產(chǎn)物解吸下來。吸著物不同,其活潑性不同,因此,應(yīng)選擇合適的洗脫劑,將蛋白質(zhì)從介質(zhì)上洗脫下來,收集分離純化的產(chǎn)物。

       離子交換層析大致有三種洗脫方式:

       一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質(zhì),可采用稀的酸、堿或鹽類溶液,也可選用適當?shù)挠袡C溶劑,其中以鹽溶液為主,依據(jù)目標產(chǎn)物的性質(zhì)及最終得到產(chǎn)物的劑型進行選擇。由于被吸著的物質(zhì)往往不是單一的品種,各種物質(zhì)所帶的電荷電量不同,與介質(zhì)的結(jié)合強度不同,即使使用同一種洗脫劑,容易被替換的物質(zhì)先脫離介質(zhì)流出,結(jié)合力較強的物質(zhì)后流出,只要通過分級收集,就可以把各種物質(zhì)分離,得到較純凈的產(chǎn)物。這種方法多用于對目標產(chǎn)物的性能了解很清楚時的分離,或用于分析類的分離。

       第二種為分步洗脫,即分別用不同濃度的鹽溶液進行洗脫。分離介質(zhì)在交換吸附過程中,會有多種蛋白質(zhì)被吸附,如果采用一個恒定的洗脫條件,有時不能將所有的組分適當?shù)胤珠_,需要改變洗脫條件??梢允请A段式的改變,即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進行洗脫,可以根據(jù)洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標蛋白,不同的鹽濃度可以得到不同的目標蛋白。這種分步洗脫的方式,適用于已知性質(zhì)蛋白的分離,尤其適用于規(guī)模生產(chǎn)中,操作方便,易于控制。

       第三種為連續(xù)的梯度洗脫,即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強度或pH值(一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式),在洗脫劑漸變的過程中,將不同的蛋白質(zhì)逐一置換,可得到各種不同的蛋白組分,同時,蛋白質(zhì)一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式,也是洗脫能力相對最強的洗脫方式,適合于對電荷性質(zhì)相近組分的洗脫。

       在洗脫過程中,順流洗脫或逆流洗脫均可采用,順流洗脫也稱為正向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相同,逆流洗脫也稱為反向洗脫,即洗脫液的流動方向與工作液的流動方向相反。若料液是自上而下正向通過交換柱進行交換吸附的,則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高,洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復雜得多,故目前多以正向洗脫為主。

       洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離的效果,洗脫速度通常要保持恒定。一般來說,慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好,但洗脫速度過慢,會造成分離時間長,樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用,所以要根據(jù)實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中于某個區(qū)域造成重疊,則應(yīng)適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率。如果分辨率較好,但洗脫峰過寬,則應(yīng)適當提高洗脫速度。

2.5 介質(zhì)的消毒:

       在某些純度要求較高的生化產(chǎn)品制備過程中,往往要求對分離介質(zhì)進行消毒處理,以防止微生物等雜質(zhì)混入目標產(chǎn)品中。

       采用高溫消毒是最常用的方法,目前大多數(shù)離子交換劑具有穩(wěn)定的物理化學性能,均可進行高溫消毒處理。但在使用多糖類介質(zhì)時,必須注意,介質(zhì)一定要處于鹽型,而且要在中性條件下才能進行高溫消毒處理,否則將會導致多糖大分子骨架的降解,嚴重影響介質(zhì)的使用壽命。

       NaOH也是一種很好的消毒劑,但要根據(jù)介質(zhì)的耐堿程度和微生物污染的種類、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內(nèi)浸泡法,即將一定濃度的NaOH通入柱中,關(guān)閉出液閥,浸泡幾個小時后,可達到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用,可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。

2.6 介質(zhì)的“復蘇”:

       在生化分離過程中,由于分離體系較為復雜,含有多種蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì),因此在使用過程中常出現(xiàn)樹脂的“中毒”現(xiàn)象。中毒原因可能是由于大分子的多點帶電,與介質(zhì)進行多點結(jié)合,致使難以洗脫,使介質(zhì)的有效功能基團減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內(nèi),難以擴散出來,堵塞了孔道,在以后的交換過程中影響到顆粒內(nèi)功能基團的有效工作。除生物大分子外,色素及腐殖酸等都可使介質(zhì)中毒。有時工作液中的膠狀物質(zhì)被粘附于介質(zhì)顆粒的內(nèi)外表面,覆蓋了功能基團,這也是影響介質(zhì)工作容量的重要因素。

       由于上述原因,離子交換層析介質(zhì)在使用一段時間后,可能出現(xiàn)顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質(zhì)收率降低、反壓升高等現(xiàn)象。此時,需要對介質(zhì)進行凈化處理。對于介質(zhì)用量比較大,自動化程度比較高的規(guī)模生產(chǎn),應(yīng)采用在原交換柱內(nèi)進行,即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過適量的清水,目的是去除交換柱中的懸浮物,并將床體疏松,還可以將結(jié)塊的介質(zhì)分散,有利于以后介質(zhì)與清洗液的接觸。對于一般的污染,采用逆流清洗,可減少污染物對下層介質(zhì)的污染。應(yīng)根據(jù)介質(zhì)種類及污染程度的不同,分別選用不同種類的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質(zhì)是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡,各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經(jīng)過上述處理后仍無明顯改善,尤其是流速無明顯提高,則要檢查交換柱布水器的紗網(wǎng)是否出現(xiàn)堵塞。

       上述過程即為通常所說的“復蘇”過程。不同的介質(zhì)應(yīng)選用不同的復蘇方法,主要取決于介質(zhì)的物理化學性能及污染物質(zhì)的性質(zhì)。對于多糖類的離子交換劑,每當使用一段時間后,可采用離子濃度較大的緩沖液通過交換柱或浸泡介質(zhì),因為緩沖液的離子強度較大時,有利于蛋白質(zhì)大分子脫離介質(zhì),達到復蘇的效果。對于物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介質(zhì),也可使用NaCl溶液通過交換柱或浸泡介質(zhì)。對于物化結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的介質(zhì),可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進行洗脫或浸泡,在高溫下可使吸附在介質(zhì)上的蛋白變性或加快擴散速度,也有利于膠體物質(zhì)的破壞,從而使污染物脫離介質(zhì)。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl,更有利于介質(zhì)的復蘇。

       清除沉淀蛋白、脂類、疏水性的蛋白及脂蛋白,處理步驟更為復雜??刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過這些清洗劑后,都要用至少2倍體積的蒸餾水進行清洗。使用有機溶劑后,交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進行清洗,即可以在5倍床體積內(nèi),使溶劑的含量從0增至100%,然后在下一個5倍床體積中,使溶劑的含量從100%降到0。

       如果經(jīng)過上述處理,交換柱的工作情況仍沒有恢復,可以使用蛋白水解酶,將仍滯留在介質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進行水解,使其脫離介質(zhì)。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中,在室溫下浸泡過夜,或在37℃下浸泡一小時。根據(jù)污染物的情況,也可以采用DNA酶等其它的酶類。無論使用哪一種酶處理后,都要重復上述清除污染物的清洗步驟,把酶清洗干凈。

       脂蛋白對分離介質(zhì)的污染比較嚴重,因為脂蛋白及其它脂類物質(zhì),很容易粘附在層析柱內(nèi),最好在進行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑,可去除高含量的脂蛋白。

2.6 介質(zhì)的貯存:

       各種分離介質(zhì)在使用后都要進行清洗后再貯存,這對于多糖類分離介質(zhì)尤為重要。分離介質(zhì)在使用后,先用2個床體積的清水清洗,然后用2個床體積的20%的乙醇過柱。對于SP強酸性陽離子介質(zhì),要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗,再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經(jīng)過處理后,可在室溫下貯存,或在4~8℃下長期存放。貯存過程中必須將層析柱全部封閉,以防止水分的揮發(fā),造成干柱。暫時不用的介質(zhì)必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質(zhì),都要在4℃~30℃的條件下貯存,并防止冷凍。



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